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微生物培養與分離的方法

2019-05-06 14:55瀏覽數:42 


接種與分離方法


根據待檢標本的性質、培養目的和所用培養基的種類,采用不同的接種方法。


1.平板劃線分離培養法
對混有多種細菌,采用劃線分離和培養,使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離,得到分散的單個菌落,以獲得純種。平板劃線分離法通常有兩種方法:


①分區劃線分離法:此法常用于含菌量較多的細菌的分離。先用接種環挑取標本涂布于瓊脂平板1區(占培養基總面積的?)并作數條劃線,再于2、3、4區依次劃線。每劃完一個區域,均將接種環燒灼滅菌1次,冷后再劃下一區域,每一區域的劃線均與上一區域的劃線交接1~3次。一個成功分區劃線的平板,培養后分別觀察1區形成菌苔,2區菌落連成線,3區和4區可分離到單個菌落。


②連續劃線分離法:此法常用于含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹,然后再用接種環或拭子在平板表面曲線連續劃線接種,直至劃滿瓊脂平板表面。


2.瓊脂斜面接種法

主要用于菌落的移種,以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。用接種環(針)挑取單個菌落或培養物,從培養基斜面底部向上劃一條直線,然后再從底部沿直線向上曲折連續劃線,直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種,用接種針挑取待鑒定細菌的菌落,從斜面中央垂直刺入底部,抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。



3.穿刺接種法

此法多用于半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種,半固體培養基的穿刺接種可用于觀察細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落,由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處,再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基,穿刺高層部分,退出接種針后直接劃線接種斜面部分。



4.液體培養基接種法

用于各種液體培養基如肉湯、蛋白胨水、糖發酵管等的接種。用接種環挑取單個菌落,傾斜液體培養管,在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體淹沒接種物為準)。此接種法應避免接種環與液體過多接觸,更不應在液體中混勻、攪拌,以免形成氣溶膠,造成實驗室污染。


5.傾注平板法

本法主要用于飲水、飲料、牛乳等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無菌培養皿內,再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無菌培養皿內,混勻,待凝固后置37℃培養,長出菌落后進行菌落計數,以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個方格(每格為1cm2)中菌落數,求出每格的平均菌落數,并算出平皿直徑,然后按下列公式計數,求出每毫升標本中的細菌數。


全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2


每ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數


6.涂布接種法

本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面,然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布,使被接種液均勻分布于瓊脂表面,然后貼上藥敏紙片,或直接培養,本法經培養后細菌形成菌苔。


細菌的培養方法



根據不同的標本及不同的培養目的,可選用不同的培養方法。通常把細菌的培養方法分為需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養四種。


1.需氧培養

是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養,將已接種好的平板、斜面、液體培養基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h,無特殊要求的細菌均可生長。少數生長緩慢的細菌需要培養3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內保持一定的濕度,可在其內放置一杯水。對培養時間較長的培養基,接種后應將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固,以防培養基干裂。


2.二氧化碳培養
某些細菌,在初次分離時,須在5%~10%二氧化碳環境中培養才能生長。常用的培養法如下。


①二氧化碳培養箱法:二氧化碳孵箱能自動調節二氧化碳的含量、溫度和濕度,培養物置于孵育箱內閣,孵育一定時間后可直接觀察生長結果。


②燭缸培養法:取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器,將接種好的培養基放入缸內,點燃蠟燭后放在缸內稍高于培養物的位置上,缸蓋或缸口均涂以凡士林,加蓋密閉。因缸內蠟燭燃燒氧逐漸減少,數分鐘后蠟燭自行熄滅,此時容器內二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內孵育。


③氣袋法:選用無毒透明的塑料袋,將已接種標本的培養皿放入袋內,盡量祛除袋內空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態,執斷袋內已置的二氧化碳產氣管(安瓿)產生二氧化碳,數分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養環境,置于35℃孵育箱內孵育。


④化學法:常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例,分別置容器內,連同容器置于玻璃缸內,蓋緊密封,傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內孵育。


3.微需氧培養

微需氧菌培養在大氣中及絕對無氧環境中均不能生長,在含有5%-6% 氧氣,5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環境中才可生長,將標本接種到培養基上,置于上述氣體環境中,35℃進行培養即微需氧培養法。


4.厭氧培養

厭氧菌對氧敏感,培養過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環境。厭氧培養常用的方法有:物理法、化學法、生物法。如厭氧罐培養法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。



細菌在培養基上生長特性



1.固體培養基
標本或液體培養物劃線接種到固體培養基表面后,單個細菌經分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細菌集團,稱為菌落(colony)。


①菌落的形態特征:大小、形狀(露滴狀、圓形、菜花樣、不規則等)、突起或扁平、凹陷、邊緣(光滑、波形、鋸齒狀、卷發狀等)、顏色(紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等)、表面(光滑、粗糙等)、透明度(不透明、半透明、透明等)和粘度等。據細菌菌落表面特征不同,可將菌落分為3型:

A.光滑型菌落(S型菌落):菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊,新分離的細菌大多呈光滑型菌落。

B.粗糙型菌落(R型菌落):菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀,邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質形成。R型細菌抗原不完整,毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數細菌新分離的毒力株就是R型,如炭疽孢桿菌、結核分枝菌等。

C.粘液型菌落(M型菌落):菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細菌、結核桿菌等。


②菌落溶血特征:菌落溶血有下列3種情況。
α溶血:又稱草綠色溶血,菌落周圍培養基出現1~2mm的草綠色環,為高鐵血紅蛋白所致;
β溶血:又稱完全溶血,菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環,是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致;
γ溶血:即不溶血,菌落周圍的培養基沒有變化,紅細胞沒有溶解或缺損。


③色素:有些細菌產生水溶性色素,使菌落和周圍的培養基出現綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色,產生的色素有水溶性或脂溶性。


④氣味:某些細菌在培養基中生長繁殖后可產生特殊氣味,如銅綠假單胞菌(生姜氣味)、變形桿菌(巧克力燒焦的臭味)、厭氧梭菌(腐敗的惡臭味)、白色假絲酵母菌(酵母味)和放線菌(泥土味)等。


2.液體培養基
細菌在液體培養基中有3種生長現象:大多數細菌在液體培養基生長繁殖后呈均勻混濁;少數鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長;枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長,常形成菌膜。


3.半固體培養基
半固體培養基主要用于細菌動力試驗,有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外,在穿刺線兩側也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長,穿刺線兩邊的培養基仍然澄清透明,為動力試驗陰性。


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